Muzeum bylo založeno roku 15. dubna roku 1818 slavnostním provoláním zemské šlechty pod názvem Vlastenské muzeum v Čechách. U zrodu stáli zástupci tehdejší české akademické veřejnosti a především šlechty, přičemž faktickými zakladateli byli hrabě František Josef z Klebelsbergu a jeho bratranec Kašpar Maria ze Šternberka, paleontolog světového významu.
Hrabě Šternberk daroval muzeu své paleontologické sbírky a evropský herbář s více jak 20 000 položkami, hrabě Josef Krakovský z Kolovrat knihovnu ze zámku v Březnici se stovkou středověkých iluminovaných rukopisů a hrabě František z Hartigu svou sbírku 600 vycpaných zvířat. Tyto sbírky se staly základem sbírek muzea.
Sbírky byly zpočátku shromažďovány v minoritském klášteře sv. Jakuba na Starém Městě a v soukromých bytech. Prvním stálým sídlem muzea se stal r. 1819 Šternberský palác na Hradčanech, zčásti pro ten účel propůjčený Společností vlasteneckých přátel umění. Dnes je zde jedno ze sídel Národní galerie.
Mezi další osobnosti raného období muzea pak patřili například také František Palacký, či hrabě Jan Dětmar z Nostic, J. T. Lindacker, František Xaver Maxmilián Zippe (zakladatel české mineralogie), botanici Tadeáš Haenke a Karel Bořivoj Presl, bratr Jana Svatopluka Presla. Jan Evangelista Purkyně, či francouzský paleontolog Joachim Barrande, jenž Národní muzeum proslavil celosvětově, nebo matematik Bernard Bolzano.
Mezi zakladateli a pokračovateli muzea byli také členové významného českého šlechtického rodu Kolowratů. Hrabě František Antonín II. se zasloužil o vznik Vlastenského muzea, odkázal mu knihovnu čítající 35 000 svazků knih a sbírku minerálů. Dále hrabě Jan Nepomuk Karel stál u zrodu a odkázal část svých sbírek a březnickou knihovnu s mnoha vzácnými prvotisky a iluminovanými rukopisy. Následně muzeum podporoval hrabě Josef Maria. Mezi další osobnosti patřili také cestovatelé Emil Holub, Vojta Náprstek, slavista Pavel Josef Šafařík, historik Karel Jaromír Erben ad.
Od roku 1848 nesla instituce název České muzeum, v období let 1854–1919 pak Museum Království českého, v letech 1919–1922 Zemské museum a od roku 1922 do 1939 Národní museum. V letech 1940–1945 se nazývalo Landesmuseum in Prag.
Před postavením vlastní budovy muzea, nyní označované jako historická či hlavní, sídlilo muzeum provizorně ve Šternberském paláci na Hradčanech (1821–1846), a dále v Nostickém paláci (1846–1892) v ulici Na příkopě 852/10 na Novém Městě. S jeho činností souvisely také další instituce, především Matice česká, zaměřená na vydávání publikací v českém jazyce, Časopis Národního muzea nebo Archeologický sbor.
Novorenesanční historická budova Národního muzea, tvořící dominantu celého Václavského náměstí, byla postavena podle projektu architekta Josefa Schulze s centrálním prostorem panteonu. Projekt vyšel vítězně ze soutěže 27 účastníků proto, že kladl důraz především na monumentalitu, zčásti na úkor funkčnosti (dobová idea Muzeum jako chrám vědy a umění), a byl otevřen roku 1891.
